阳离子化无定形碳酸钙加填纸的制备及其蛋白分离功能

摘要

本研究采用液相沉积法，以氯化钙和碳酸钠为原料，引入氯化镁作为晶型稳定剂，成功合成了无定形碳酸钙（amorphous calcium carbonate，ACC）。对ACC进行阳离子化改性，以增强其正电性和分散性。结果表明，阳离子化ACC具有良好的吸附性能；当阳离子试剂质量浓度为2.0 mg/mL，制备的阳离子化无定形碳酸钙加填量为40%时，对牛血清白蛋白的吸附量为92 mg/g。

关键词

无定形碳酸钙; 阳离子化; 蛋白质分离; 功能纸

在医学、环境监测和食品安全等关键领域，迅速获取准确检测结果的即时检测至关重要。通过缩短等待时间，有助于快速应对紧急情况，可以有效防范潜在风险。免疫层析法凭借其操作简便和迅速可见结果的独特优势，成为即时检测中不可或缺的关键技术^[1]。基于抗原-抗体特异性相互作用^[2]，免疫层析法可以确保检测结果的准确性，为快速决策提供可靠的依据；通过在复杂样本中迅速筛选和鉴定目标分子，还展现出一定的高效性。上述特点使免疫层析法在即时检测中发挥着关键作用，为各个领域的紧急决策提供了强有力的支持。

目前，免疫层析法广泛采用的纸基材料主要包括硝化纤维素膜和纤维素纸。硝化纤维素膜具有高蛋白结合亲和力，有助于有效固定捕获剂，从而提高检测灵敏度。此外，硝化纤维素膜与多种检测模式兼容，如比色、荧光等，使其在不同应用场景中具备出色的灵活性。然而，硝化纤维素膜相对较高的价格限制了其在一些领域的广泛应用。纤维素纸作为另一种纸基功能材料常用的原料，在纸基微流体技术^[3]中的应用得到了广泛发展，如水体环境检测^[4]等。通过折纸^[5-7]或其他构建流体通道的工艺，纤维素纸能够支持更为复杂的检测操作，为免疫层析法的应用提供了更多可能性。此外，纤维素的低成本和来源广泛使其具有巨大的应用潜力。然而，纤维素纸的蛋白结合亲和力较低^[8]，一定程度上限制了其在检测过程中的精确性，因此在实际应用中，需要权衡其成本与性能之间的关系。这也促使研究人员不断寻求提高纤维素纸蛋白吸附分离性能的策略，进一步拓展其在免疫层析法中的应用领域。

为了增强纤维素纸对蛋白质的亲和力，研究人员采用了多项策略，包括在纤维素纸的表面修饰引入不同官能团，如胺基^[9]、羧基^[10]等，增加其与蛋白质相互作用的位点；调控纤维素纸的孔隙结构^[11-12]，以增加其比表面积，从而提供更多结合位点；调控纤维素纸表面电荷特性，通过改变pH值、表面修饰^[13]等方式，实现对蛋白质亲和力的调控；在纤维素骨架引入具有特定亲和力的功能基团，如亲和层析柱中的配体，以增强纤维素纸与目标蛋白质的结合；采用多组分混合策略^[14]，利用与其他具有高亲和力的材料协同作用，提高纤维素纸的蛋白质吸附性能。尽管对纤维素纸的研究较为深入，但关于纤维素纸基材料制备过程中加入填料对蛋白质吸附性能的影响，目前仍缺乏深入的研究。

目前，针对填料改性已有许多研究。朱宏伟等^[15]利用阳离子淀粉与碳酸钙进行预絮聚，将填料留着率提高了24%左右。吴盼等^[16]探究了粉煤灰联产新型活性硅酸钙填料制备的性能及其对纸张性能的影响，使用制备的硅酸钙作为填料的纸张，其光学性能及强度均有一定提升。刘银等^[17]在Ca(OH)₂/H₂O/CO₂体系中，对重质碳酸钙表面进行包覆改性，改性后的填料留着率增加，并且制备纸张的强度也有所增强。但这些针对于填料的改性目前仅停留于提高其留着率或改善纸张物理性能，并没有赋予纸张额外的功能性。

本研究通过对填料碳酸钙进行改性，达到增强纤维素纸基材料与蛋白质之间的结合作用的目的。本研究思路如图1所示。首先采用环境友好的液相沉积法，设计和合成一种新型阳离子化无定形碳酸钙，简称CACC。采用CACC作为填料抄纸，并探讨了CACC对纤维素纸蛋白吸附性能的影响。

图1  CACC及CACC加填纸的制备示意图

Fig. 1  Schematic of the preparation of CACC and CACC-filled paper

1 实验

1.1　实验原料及仪器

1.1.1　实验原料

漂白化学针叶木浆（打浆度30 °SR）；氯化镁（分析纯，质量分数98%）、牛血清白蛋白（BSA，分析纯，纯度98%）、PBS缓冲液（NaH₂PO₄/Na₂HPO₄）、考马斯亮蓝染色剂，分析纯，以上产品均购自北京百灵威科技有限公司；无水氯化钙（分析纯），天津市天力化学试剂有限公司；无水碳酸钠（分析纯），天津市博迪化工有限公司；阳离子试剂，自制。

1.1.2　仪器与设备

Vertex70傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR），德国Bruker公司；VEGA 3 SBH能谱仪（EDS），捷克Tescan；Nano-ZS表面电位分析仪，英国Malvern公司；TU-1900紫外分光光度计，北京谱析通用仪器有限公司；9902070标准纤维解离器，瑞典L&W公司；TD10-200纸页成型器，咸阳通达轻工设备有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1　碳酸钙的制备

称取0.111 g氯化钙溶解在10 mL去离子水中，配制成A溶液；称取0.095 g氯化镁溶解在10 mL去离子水中，配制成B溶液；称取0.106 g碳酸钠溶解在10 mL去离子水中，配制成C溶液。室温下，将A溶液与B溶液按体积比1.5∶1混合，控制搅拌速度，加入等体积的C溶液反应1 h，在8 000 r/min转速下离心8 min，得到沉淀碳酸钙（ACC）；用去离子水洗涤3次，在60 ℃下真空干燥48 h，在干燥器内储存。未添加氯化镁制得的碳酸钙样品为CaCO₃-O，晶型为方解石型。

在ACC沉淀成形10 s后向体系中加入阳离子试剂，控制阳离子试剂质量浓度分别为1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL；反应1 h，在8 000 r/min转速下离心8 min；得到阳离子化无定形碳酸钙（CACC），用去离子水洗涤3次，在60 ℃下真空干燥48 h，在干燥器内储存。

1.2.2　CACC加填纸的制备

将1.2.1中制备得到的CACC与一定量的漂白化学针叶木浆共同置于疏解机中，控制CACC加添量为10%~40%（相对于绝干漂白化学针叶木浆），疏解30 min，使填料与纤维充分接触，抄纸得到CACC加填纸，在干燥器中储存。

1.2.3　BSA的吸附

1.2.3.1　碳酸钙对BSA的吸附性能

取100 mg的BSA溶于100 mL的PBS缓冲液中，配制成1 mg/mL的BSA溶液。取0.1 g碳酸钙样品置于20 mL、1 mg/mL的BSA溶液中，在37 ℃、100 r/min摇床中振荡2 h，离心，收集上清液，利用紫外可见分光光度计测量上清液在278 nm处的吸光度，并根据标准曲线得到吸附后浓度，计算吸附量。吸附率（%）与吸附量（mg/g）可根据式(1)和式(2)进行计算。

$$\mathrm{吸附}\mathrm{率}=\frac{C_{\mathrm{0}}-C_{\mathrm{e}}}{C_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}$$

（1）

$$\mathrm{吸附}\mathrm{量}=\frac{(C_{\mathrm{0}}-C_{\mathrm{e}})·V}{m}$$

（2）

式中，C₀和C_e分别是溶液中BSA的初始浓度和吸附后浓度，mg/mL；V是BSA溶液的体积，mL；m是碳酸钙样品的质量，g。

1.2.3.2　CACC加填纸对BSA的吸附性能

取100 mg的BSA溶于100 mL的PBS缓冲液中，配制成1 mg/mL的BSA溶液。量取0.1 g的CACC加填量为0~40%（相对于绝干漂白化学针叶木浆）的加填纸置于20 mL、1 mg/mL的BSA溶液中，在37 ℃、100 r/min摇床中振荡2 h，离心，收集上清液，利用紫外可见分光光度计测量上清液在278 nm处的吸光度，并根据标准曲线得到吸附后浓度，计算吸附量和吸附率。将1.2.2中制备的加填纸裁成长条悬挂，下端置于BSA溶液中，待加填纸被完全润湿后，利用考马斯亮蓝染色剂对加填纸进行染色，观测其变化。

1.3　材料性能表征

1.3.1　结构及元素

利用FT-IR在500~4 000 cm^-1范围内对样品进行扫描分析。

使用EDS分析样品表面的元素组成。

1.3.2　表面电位分析

利用表面电位分析仪对样品表面电位进行分析。样品分散于去离子水中形成分散液，进行3次测试，结果取平均值。

2 结果与讨论

2.1　阳离子试剂浓度对CACC晶型及Zeta电位的影响

本研究主要探讨阳离子试剂浓度对CACC晶型及表面Zeta电位的影响，结果列于表1。

表1  阳离子试剂浓度对CACC晶型及Zeta电位的影响

Table 1  Effect of cationic reagent concentration on crystal shape and Zeta potential of CACC

样品	阳离子试剂质量浓度/(mg∙mL-1)	晶型	Zeta电位/mV
CACC-1	1.0	无定形	6.7
CACC-2	2.0	无定形	11.2
CACC-3	4.0	无定形+方解石	12.7
CACC-4	8.0	方解石	12.5

从表1可以看出，低浓度的阳离子试剂能在一定程度上起到抑制CACC结晶的作用，但当阳离子试剂浓度过高时，阳离子试剂的分子之间可能形成致密的包裹层，反而促使CACC结晶的产生。此反应机理类似于胶体稳定剂。胶体稳定剂在适当浓度下可以稳定颗粒，但在过高浓度下会产生胶束凝聚。因此CACC的Zeta电位在阳离子试剂质量浓度大于2.0 mg/mL后增加幅度较小。本研究选择阳离子试剂质量浓度为2.0 mg/mL的样品CACC-2进行后续研究。

2.2　CACC的结构及Zeta电位分析

溶液中的ACC形成通常包括以下几个步骤：核化、生长、凝聚等。因为ACC不稳定，溶液中的ACC颗粒易发生相变，转变成更稳定的晶体形式，如方解石或球霰石^[18]。本研究采用FT-IR表征了CaCO₃-0、ACC及CACC-2的化学结构，如图2所示。

图2  CaCO₃-0、ACC和CACC-2的FT-IR谱图

Fig. 2  FT-IR spectra of CaCO₃-0, ACC, and CACC-2

在图2中，CaCO₃-0的FT-IR谱图显示在1 430 cm^-1处有较窄的ν₃吸收峰，875 cm^-1处（$\mathrm{C}{\mathrm{O}}_{\mathrm{3}}^{\mathrm{2}-}$的面外弯曲）有较强的ν₂吸收峰，在713 cm^-1处（$\mathrm{C}{\mathrm{O}}_{\mathrm{3}}^{\mathrm{2}-}$的面内弯曲）有较强的ν₄吸收峰，这是典型的方解石型碳酸钙所具有的特征峰。当加入氯化镁后，制备的ACC的FT-IR谱图中，1 487 cm^-1和1 423 cm^-1处分裂为双峰，ν₂吸收峰由875 cm^-1移至868 cm^-1处，713 cm^-1处出现微弱的宽峰，这些均归属于ACC的特征峰，验证了ACC的生成。在1 608 cm^-1附近出现的吸收峰，其归属于水分子中O—H的非对称伸缩振动，说明Mg²⁺的掺杂可以提高ACC中的含水量。制备的CACC-2的FT-IR谱图显示，阳离子试剂加入后，1 608 cm^-1处的峰相对强度增强，表明阳离子试剂进一步提高了CACC中的含水量，已有研究表明，适量的水分有助于提高碳酸钙的稳定性^[19]。

采用EDS分析了CACC-2的表面元素及其分布，如图3所示。由图3可以看出，CACC-2样品中C、O、Ca、N、Mg等元素分布均匀，同时可以明显观察到CACC表面具有丰富的N元素分布。这些N元素都是来自阳离子试剂中的铵根，说明阳离子成功负载于CACC表面。

图3  CACC-2的EDS谱图

Fig. 3  EDS spectra of CACC-2

通过Zeta电位仪对CaCO₃-0、ACC和CACC-2进行表征，结果如图4所示。从图4可以看出，无任何添加剂制备得到的CaCO₃-0呈现负电位，与之前研究得到的结论一致^[20]。加入氯化镁之后，由于Mg²⁺的掺杂，ACC的电位由负转正，带了微弱的正电。阳离子试剂修饰之后，CACC-2的Zeta电位有了较为明显的提升，此时电位为11.2 mV。而BSA的电位为-5.32 mV，能够与CACC间形成静电吸引作用，从而有利于后续吸附性能的提高。

图4  CaCO₃-0、ACC和CACC-2及BSA的Zeta电位

Fig. 4  Zeta potential of CaCO₃-0, ACC, CACC-2, and BSA

2.3　碳酸钙对BSA的吸附性能

2.3.1　碳酸钙类型对吸附性能的影响

CaCO₃-0、ACC及CACC-2对BSA的吸附量如图5所示。通过图5可以明显观察到，CACC-2的吸附量显著高于CaCO₃-0和ACC，达102 mg/g。这表明氯化镁和阳离子试剂的添加在改善碳酸钙的粒径和表面电荷方面起到了积极作用，这可能是由于氯化镁优化了碳酸钙的结构，而阳离子试剂的引入提高了碳酸钙表面的亲水性并增加了活性位点，从而有利于蛋白质的吸附。这为进一步探讨氯化镁和阳离子试剂在CACC中的协同效应，以及其在检测领域的应用提供了有益的启示。

图5  碳酸钙类型对BSA吸附性能的影响

Fig. 5  Effect of the CaCO₃ type on the adsorption capacity of BSA

2.3.2　CACC带电量对吸附性能的影响

将不同浓度阳离子试剂制备的CACC用于BSA吸附实验，研究阳离子含量对CACC吸附性能的影响，结果如表2所示。由表2可知，低浓度阳离子试剂修饰的CACC（CACC-1、CACC-2）表现出更高的吸附量和吸附率，这一结果归因于低浓度的阳离子试剂以一种均匀、分散的方式包裹在了ACC的表面，使其具有更高的亲和力及Zeta电位，从而增加了对BSA的吸附量。但过高浓度的阳离子试剂易引发“胶束凝聚”反应，导致了碳酸钙的结晶聚集，从而减小了CACC表面可供蛋白吸附的区域，因此吸附量有所下降。基于这些结果，本研究选择CACC-2作为填料进行抄纸，以确保制备得到的加填纸具备最佳的蛋白吸附分离性能。

表2  CACC对BSA的吸附量与吸附率

Table 2  Adsorption capacity and adsorption rate of CACC towards BSA

样品	C0/(mg∙mL-1)	Ce/(mg∙mL-1)	吸附量/(mg∙g-1)	吸附率/%
CACC-1	1.00	0.63	74	37
CACC-2	1.00	0.49	102	51
CACC-3	1.00	0.69	62	31
CACC-4	1.00	0.84	32	16

2.4　CACC-2加填纸对BSA的吸附性能

利用CACC-2作为填料，加填量为30%抄纸，得到CACC-2加填纸。将已裁成细长条的CACC-2加填纸悬挂，使其下端浸泡在1 mg/mL的BSA溶液中。依靠毛细管力，等待BSA溶液完全润湿纸条，使用考马斯亮蓝染色剂对其进行染色，照片如图6所示。

图6  CACC-2加填前后纸张对BSA吸附图片及吸附过程示意图

Fig. 6  BSA adsorption photos of paper before and after CACC-2 filled and the schematic of adsorption process

注   a为未加填纸，b为加填纸。

图6中未加填纸在染色后，观察到BSA均匀分布于纸张上，表明纤维素对蛋白质没有亲和力或亲和力很弱^[8]。在CACC-2加填纸中，染色后明显可以看出，BSA集中分布于纸张的下端，而纸张的上端无蛋白分布。这与Wang等通过化学试剂处理纸基芯片取得的效果一致^[14]。说明CACC对蛋白质具有高亲和力和吸附性。

不同加填量的CACC-2加填纸对BSA的吸附量列于表3。从表3可以看出，相对于未加填纸，不同加填量的CACC-2加填纸均对BSA表现出较高的亲和力，并且随着加填量的增加，吸附率也在逐步上升。但是过多的填料会导致纤维之间的交织减弱，使纸张的物理性能下降，CACC-2加填量达40%的加填纸虽然吸附量较高，但在吸附过程中，纸张易出现破损现象。

表3  不同加填量的CACC-2加填纸对BSA的吸附量与吸附率

Table 3  Adsorption capacity and adsorption rate of BSA on different CACC-2 filled papers with different dosage of CACC-2

CACC-2加填量/%	C0/(mg∙mL-1)	Ce/(mg∙mL-1)	吸附量/(mg∙g-1)	吸附率/%
0	1.0	0.78	44	22
10	1.0	0.69	62	31
20	1.0	0.63	74	37
30	1.0	0.56	88	44
40	1.0	0.54	92	46

3 结论

3.1 当阳离子试剂质量浓度为2.0 mg/L时，阳离子化无定形碳酸钙的Zeta电位为11.2 mV，对牛血清白蛋白（BSA）吸附量最高可达到102 mg/g。

3.2 阳离子化无定形碳酸钙加填纸对BSA的吸附实验表明，加填纸对BSA有较好的吸附能力，阳离子化无定形碳酸钙加填量为40%时，加填纸对BSA的吸附量达92 mg/g。

3.3 相较于为了提高纸张对蛋白的亲和力而针对纤维素进行的一系列改性研究，加填改性不仅可以有针对性地调控填料表面的化学性质，使其更有利于特定蛋白的吸附，实现对吸附特性的定向调控，而且可以优化纸张结构，包括纸张的孔隙率、力学强度、表界面性质等。阳离子化改性无定形碳酸钙加填纸独特的结构和良好的吸附性能，为其在生物医学和生物工程领域的应用打开了新的研究方向。这一研究不仅提供了对碳酸钙的新型调控策略，而且为纸基检测材料的设计和改良提供了新思路。