超声波-游离亚硝酸联合预处理污泥强化厌氧消化的机制解析

摘要

本研究对超声波（US）预处理、游离亚硝酸（FNA）预处理及超声波-游离亚硝酸（US-FNA）联合预处理对于污泥有机质溶出、絮体分散、细胞内容物释放及产甲烷性能的作用进行评估。结果表明，US预处理的主要作用是使絮体分散与胞外聚合物溶出，FNA预处理则是使细胞内容物释放。US-FNA联合预处理后，污泥甲烷产率较未预处理增加了37.1%，分别达到US预处理的1.07倍和FNA预处理的1.08倍，但US与FNA在联合预处理中所发挥作用各自独立，并未发现明显的协同增效作用。引入FNA会降低污泥厌氧消化初期产气速率，未对累积产气量造成显著影响。根据发酵后污泥微生物菌群的解析，发现FNA是影响污泥微生物多样性的主导因素。

关键词

超声波; 游离亚硝酸; 剩余污泥预处理; 厌氧消化

我国造纸行业和纸制品加工行业化学需氧量排放量占全国工业源的44%，好氧活性污泥法是造纸企业废水处理不可或缺的手段。剩余污泥是好氧活性污泥法处理废水衍生的有机固体废物。据统计，造纸废水的干污泥产生量约40~50 kg/t纸^[1]。随着造纸企业产能扩张与环保标准的提升，剩余活性污泥的产生量不断增加，如何实现污泥的合理处理与处置已成为造纸行业绿色发展的新挑战。

厌氧消化是污泥资源化利用的传统工艺，能够回收生物燃气及有机肥^[2]。厌氧消化利用微生物菌群的水解、酸化及甲烷化作用，将污泥中蛋白质、多糖等有机物转化为有机酸、沼气等产物^[3]。剩余污泥中的有机物以胞外聚合物和细胞内容物2种形态存在；胞外聚合物包裹于污泥絮体内，不易与游离胞外水解酶结合；细胞内容物则受到细胞膜保护，难以与水解酶接触，导致水解酸化成为污泥厌氧消化的限速步骤。污泥预处理旨在利用物理法^[4-5]、化学法^[6-8]和生物法^[9-11]强化污泥有机物的溶出与水解，为高效产甲烷提供可代谢底物。游离亚硝酸（free nitrous acid, FNA）具有生物杀灭和抑制效应，能够破坏污泥絮体和细胞完整性，从而提高污泥的絮凝性、流动性和疏水性，驱动胞外聚合物和细胞内容物向溶液相释放，已成为近年来广受关注的污泥化学预处理手段^[12]。FNA强化厌氧产甲烷的核心机制是破坏细胞膜、加速细胞内容物释放，但对于污泥絮体的分散作用有限^[13]。

热处理及超声波处理等污泥预处理技术通常具有较好的污泥絮体分散作用。Wang等^[14]使用FNA-热联合预处理剩余污泥，FNA预处理与热处理协同作用显著提升了污泥的生化甲烷潜力，甲烷产率优于单独采用FNA预处理或加热预处理。污泥FNA-热联合预处理的能耗且装备成本相对较高，且FNA浓度与环境温度呈负相关，制约了该技术的实际应用。超声波（Ultrasound，US）法可利用超声波的机械剪切、空化和热效应，破坏污泥的絮体和细胞结构，促使有机物从细胞内和絮体中释放，从而提升污泥中有机质的释放效果，增强后续厌氧消化的速率^[15]。Niu等^[16]将US预处理和FNA预处理联合使用，用于提高剩余污泥氢气产率。结果显示，US-FNA联合预处理的氢气产量较单独US预处理和单独FNA预处理分别提升了2.21倍和1.36倍。值得注意的是，污泥联合预处理通常能够提高污泥中溶解性有机物浓度及发酵转化效率，但诸如US与FNA在联合预处理过程中是否存在协同效应仍待探讨。

本研究以制浆造纸企业剩余污泥为研究对象，采用超声波（US）预处理、游离亚硝酸（FNA）预处理及超声波-游离亚硝酸（US-FNA）联合预处理，对比评估了预处理方式对于污泥有机质溶出、絮体分散、细胞内容物释放及产甲烷性能的作用，旨在解析US和FNA在US-FNA联合预处理中是否存在协同促进作用，为污泥联合预处理的技术开发提供参考。

1 材料与方法

1.1　剩余污泥基本性质

剩余污泥取自南宁市某造纸废水处理厂。该厂采用厌氧生物处理法处理废水，废水进水流量约40 000 m³/d，二沉池中pH值约6.6。该厂的二沉池中污泥与聚丙烯酰胺混合后经由脱水机形成脱水污泥。本研究将脱水污泥置于密封袋中，冷藏保存。接种污泥取自广西贵糖集团厌氧反应器中的厌氧颗粒污泥，颗粒污泥经破碎后常温保存。实验中所使用的污泥总悬浮固体设定为2%，污泥的基本性质见表1。

表1  污泥的基本性质

Table 1  Basic characteristics of sludge

污泥种类	TSS /%	VSS/TSS /%	TCODCr /（mg·gVSS-1）	SCODCr /（mg·gVSS-1）	pH值
剩余污泥	15	43	2 003	16	6.6
接种污泥	10	65	1 323	41	8.1

注   TSS为污泥总悬浮固体；VSS为挥发性悬浮固体；TCOD为污泥的总化学需氧量；SCOD为可溶性COD。

1.2　序批实验

1.2.1　超声预处理

取200 mL剩余污泥置于250 mL烧杯中，将超声波探头（JY92-IIDN，宁波新芝生物科技股份有限公司）置于污泥液面下1 cm处。通过设置不同超声（US）强度（0.3、0.5、1.0 W/mL）、US时间（5、10、15 min）对剩余污泥进行US预处理。考察US预处理强度和时间对于剩余污泥絮体解离、细胞内容物释放的影响，确定最佳US预处理条件。

1.2.2　游离亚硝酸预处理

取200 mL剩余污泥置于250 mL烧杯中，设置温度为25 ℃，使用盐酸溶液（1 mol/L）将pH值调整为5.5和6.5；反应时间为1、3、5 h；亚硝酸质量浓度为0、100、200、300、400、500 mg/L。FNA质量浓度通过式(1)计算^[17]，在pH值为5.5时，FNA质量浓度为0、0.71、1.42、2.13、2.84、3.55 mg/L；在pH值为6.5时，FNA质量浓度为0、0.071、0.142、0.213、0.284、0.355 mg/L。考察FNA预处理浓度和预处理时间对于剩余污泥絮体解离、细胞内容物释放的影响，确定最佳FNA预处理条件。

$$C_{\mathrm{F}\mathrm{N}\mathrm{A}}=\frac{C_{N{O}_{\mathrm{2}}^{-}-N}}{e^{-\mathrm{2}\mathrm{300}/(\mathrm{273.15}+T)}\times {\mathrm{10}}^{pH}}$$

（1）

式中，C_FNA为FNA浓度，mg/L；T为反应器内的温度，℃；$C_{\mathrm{N}{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{-}-\mathrm{N}}$为亚硝酸钠浓度，mg/L。

1.2.3　超声波-游离亚硝酸联合预处理

在上述单独预处理实验的基础上，选取合适条件，对剩余污泥进行US-FNA联合预处理。通过考察US-FNA联合预处理对于剩余污泥絮体解离、细胞内容物释放和累计产气量来评估该联合预处理方法的性能。

1.3　生化甲烷潜力测试

US-FNA联合预处理污泥在体积为500 mL的厌氧消化单元中，以接种物︰底物（VSS∶TSS）=2︰1的体积比进行接种，在自动甲烷潜力测试系统（AMPTS Ⅱ，瑞典生物过程控制公司）中进行生化甲烷潜力（BMP）测试。为排除接种物产沼气的影响，本研究进行了空白实验，去除了接种物的背景沼气量。将所有反应器充满氮气以达到厌氧条件。在半连续搅拌下于(35±1)℃进行BMP测试30天。实验设计如表2所示。在本研究中选用Gompertz模型描述反应器的产气动力学^[18]，并用Matlab进行模拟。t时刻甲烷产率计算见式(2)。

$$M=P·\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}\left\{-\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}\left[\mathrm{1}+\frac{\left(\lambda -t\right)\left(R_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}·e\right)}{P}\right]\right\}$$

（2）

式中，M表示t时刻甲烷产率，mLCH₄/gVSS；P表示最终甲烷产率，mLCH₄/gVSS；t表示预处理时间，d；R_max表示产甲烷速率，mLCH₄/(gVSS·d)；λ表示停滞时间，d。

表2  生化甲烷潜力实验

Table 2  Methane production potential test

预处理方式	编号	US时间/min	US强度/(W·mL-1)	$\mathrm{N}{\mathrm{O}}_2^{-}$浓度/(mg·L-1)	FNA浓度/(mg·L-1)
对照组	UN			0	0
US预处理	US	15	1.0	0	0
FNA预处理	F1			100	0.71
	F2			200	1.42
	F3			300	2.13
	F4			400	2.84
	F5			500	3.55
US-FNA 联合预处理	USF1	15	1.0	100	0.71
	USF2	15	1.0	200	1.42
	USF3	15	1.0	300	2.13
	USF4	15	1.0	400	2.84
	USF5	15	1.0	500	3.55

1.4　分析方法

1.4.1　污泥检测

粒度分布：使用激光粒度分布仪（Bettersize 2600）对剩余污泥进行粒度分布测试。

固体含量：TSS和VSS均按照标准方法进行测定，污泥的溶解度根据式(3)计算^[19]。

$$\mathrm{D}{\mathrm{D}}_{\mathrm{C}\mathrm{O}\mathrm{D}}=\frac{\mathrm{S}\mathrm{C}\mathrm{O}{\mathrm{D}}_t-\mathrm{S}\mathrm{C}\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{0}}}{\mathrm{T}\mathrm{C}\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{0}}-\mathrm{S}\mathrm{C}\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}$$

（3）

式中，DD_COD表示污泥溶解度，%；TCOD₀表示未处理污泥的TCOD，mg/L；SCOD₀、SCOD_t分别表示未处理污泥和预处理污泥的SCOD，mg/L。

胞外聚合物（EPS）的提取：将25 mL污泥样品在4 ℃和转速8 000 r/min的条件下离心15 min，收集到的上清液为黏液态EPS（S-EPS）；向沉淀物中加入NaCl溶液（质量分数0.05%，70 ℃）使剩余的污泥沉淀物重新悬浮至初始体积，然后，使用涡旋振荡器将其充分混合后离心（转速8 000 r/min，10 min），收集到的上清液为疏松结合的EPS（L-EPS）；继续向沉淀物中添加NaCl溶液至初始体积，将其在60 ℃的水浴中热处理30 min，在转速8 000 r/min下离心10 min，收集上清液作为紧密结合的EPS（T-EPS）。

EPS的检测：多糖含量采用硫酸-蒽酮法测定^[20]，蛋白质含量采用Folin-酚法进行分析^[21]。

DNA的检测：DNA浓度采用二苯胺法进行测定。

1.4.2　废水检测

COD_Cr测定：根据HJ/T 399—2007《水质 化学需氧量的测定 快速消解分光光度法》，采用快速消解法，在COD消解仪上进行测定。

2 结果与讨论

2.1　US-FNA联合预处理对污泥粒径分布的影响

图1为US强度与时间对污泥粒径分布的影响。由图1可知，污泥絮体平均粒径随着US强度的增加而降低，由119.5 μm降低至29.3 μm，US预处理后粒径约1 200 μm的大尺寸絮体消失，随着US时间的延长，污泥絮体的平均粒径逐步减小。这表明US预处理具有污泥絮体的分散效果。有研究表明，超声波（20 kHz~10 MHz）引发污泥内部气穴发生超声空化现象，形成局部高温、高压与高剪切环境，进而分散污泥絮体、破坏细胞膜，导致胞外聚合物及细胞内容物释放^[22]。US预处理不仅会破坏污泥絮体结构，还将引发多肽、相对分子质量较低的蛋白质等胞外聚合物的剥离与溶出^[23]。溶解态有机物降解效率高，有助于提高微生物对厌氧消化体系中有机物质的利用。

图1  US强度与时间对污泥粒径分布的影响

Fig. 1  Effects of ultrasound intensity and time on particle size distribution of sludge

图2为FNA浓度对污泥粒径分布的影响。从图2可以看出，将FNA浓度从0.71 mg/L提高至3.55 mg/L，并不会引发污泥粒径的下降，表明FNA预处理对于污泥絮体的分散作用并不显著。FNA是亚硝酸盐的质子化形式，污泥预处理中主要作用是破坏污泥细胞的细胞膜进而促进细胞内容物释放^[24]。

图2  FNA浓度对污泥粒径分布的影响

Fig. 2  Effects of different FNA concentrations on particle size distribution of sludge

图3为US-FNA联合预处理对污泥粒径分布的影响。图3清晰地展示了US预处理是分散污泥絮体、降低污泥粒径的主要因素。FNA预处理（F4）污泥与对照组（UN）污泥的粒径分布曲线基本重合，其平均粒径高于US预处理污泥与US-FNA联合预处理（USF4）污泥。US-FNA联合预处理污泥平均粒径较US预处理反而略微升高，至154 μm，该现象可能与FNA改变了溶液中的离子强度并压缩双电层，导致体系中分散的絮体发生二次絮凝有关^[25]。上述研究表明，US-FNA联合预处理中导致污泥絮体分散的主要因素是US预处理。

图 3  US-FNA联合预处理对污泥粒径分布的影响

Fig. 3  Synergetic effects of US-FNA pretreatment on particle size distribution of sludge

2.2　US-FNA联合预处理对有机物溶出的影响

污泥中所含有机物可根据赋存位置分为胞外聚合物与细胞内容物，上述有机物在预处理过程中部分会转化为溶解态，可用SCOD_Cr进行量化分析。图4展示了US-FNA联合预处理对有机物的溶出作用。图4(a)和图4(b)为US预处理对溶解态有机物浓度的影响。由图4(a)和图4(b)可知，溶解态有机物浓度会随着US强度的增加和US时间的延长而提升。未经US预处理的对照组溶解性有机物的SCOD_Cr为210.3 mg/L，经US处理后，SCOD_Cr均可上升至611.1 mg/L以上。图4(c)和图4(d)所示为FNA预处理对溶解态有机物浓度的影响。由图4(c)和图4(d)可以看出FNA预处理同样具备促进污泥有机物溶出的作用。根据FNA浓度计算公式（式(1)）可知，提高FNA浓度的手段包括提高总亚硝酸盐浓度以及降低pH值，在固定亚硝酸盐浓度条件下，降低溶液pH值有利于提高污泥有机物溶出效果，延长预处理时间也有助于释放有机物。如在pH值为5.5、FNA浓度为3.55 mg/L、反应时间为5 h的条件下，SCOD_Cr的释放量达到最大值，由对照组的226 mg/L增加到了960 mg/L，提高了4.2倍。通过比较预处理后样品溶液的SCOD_Cr水平可知，FNA预处理后污泥样品的溶解态有机物浓度并未达到US预处理的水平。

图 4  US-FNA联合预处理对有机物的溶出作用

Fig. 4  Synergetic effects of US-FNA pretreatment on dissolution of organic matters

图4(f)分析了预处理方式对有机物溶出量及污泥溶解度的影响。如图4(f)所示，US-FNA联合预处理（USF4）的有机物溶出量可达2 134.5 mg/L，是UN预处理有机物溶出量（225.8 mg/L）的9.5倍，污泥溶解度达11.1%。US-FNA联合预处理虽然取得了更高的有机物溶出与污泥溶解效果，但US-FNA联合预处理所释放的溶解性有机物总量约等于US预处理与FNA预处理形成的溶解性有机物之和（图4(e)），表明US预处理与FNA预处理对污泥有机物的溶出效果相互独立并且可叠加，这不仅意味着US-FNA联合预处理过程中US预处理与FNA预处理之间并未产生明显的协同效应，还说明污泥在US预处理与FNA预处理所释放的有机物可能分别源自不同有机物赋存形态。

溶出有机物中是否含有脱氧核糖核酸（DNA）是区分胞外聚合物与细胞内容物的关键证据。图5是US-FNA联合预处理对细胞的破碎作用。如图5(a)~图5(d)所示，US预处理的破壁作用及其有限，其污泥清液中DNA浓度与FNA预处理的DNA浓度存在显著差异。FNA预处理过程中释放的DNA浓度最高可达4 239.5 mg/L，表明FNA预处理过程中细胞膜破裂程度远高于US预处理，释放了更多细胞内容物，且低pH值有利于增加FNA浓度，进一步提高了细胞破壁效果。图5(e)对比US-FNA联合预处理释放的DNA浓度，发现FNA预处理是决定联合预处理中细胞破壁释放细胞内容物质的决定性因素。FNA可以直接诱导脂质过氧化并破坏细胞膜，亚硝酸盐的副产物（如NO、N₂O₃和NO₂）破坏蛋白质的功能或诱导细胞损伤，是导致细胞死亡和裂解的原因^[26]。上述分析表明，US-FNA联合预处理对于细胞破解的作用由FNA主导，US对于FNA细胞破解的促进作用微乎其微。

图 5  US-FNA联合预处理对细胞的破碎作用

Fig. 5  Synergetic effects of US-FNA pretreatment on cell breakage

2.3　US-FNA联合预处理对EPS的影响

胞外聚合物（EPS）是污泥所含有机物的主要形态之一，是微生物生长和代谢过程中通过内分泌、细胞凋零及外部吸附等途径形成的有机大分子（以蛋白质与多糖为主）的总称。根据EPS与污泥的结合强度，可将其分为紧密结合态EPS（T-EPS）、疏松结合态EPS（L-EPS）和黏液态EPS（S-EPS）^[27]。T-EPS可稳定地附着于细胞表面；L-EPS较为松散地分布于细胞外部且并不与细胞直接接触；S-EPS是最易释放至液相中形成溶解性有机物的胞外聚合物形态。

图6为US-FNA联合预处理对EPS释放的促进作用。从图6可以看出，US预处理和FNA预处理对于EPS中蛋白质与多糖的溶出促进作用存在差异。在胞外蛋白质释放方面，US预处理能够显著增加S-EPS与L-EPS的含量，其中S-EPS中的蛋白质含量比对照组提高了14.5倍，从对照组的49.3 mg/L增加至713.5 mg/L（图6(a)）。与之相比，FNA对于促进胞外蛋白质释放与溶出的贡献有限。多糖溶出方面（图6(b)），FNA预处理对于多糖溶出的贡献超过US预处理。将图6(b)与图5(e)对比可知，预处理对于污泥中多糖与DNA溶出释放的作用相吻合，结合FNA对于细胞结构完整性的破坏作用，说明上述2种组分均可能源自细胞破裂释放的细胞内容物。

图 6  US-FNA联合预处理对胞外聚合物释放的促进作用

Fig.6  Synergistic effect of US-FNA pretreatment on extracellular polymer release

总体而言，US-FNA联合预处理将US强化胞外蛋白释放与FNA提升细胞内多糖溶出的作用相结合，获得了实验条件下最高的蛋白质与多糖溶出效果，并且溶出的蛋白质与多糖主要赋存于生物降解性较好的S-EPS中，为提高污泥厌氧消化效率奠定了基础。

2.4　US-FNA联合预处理对产甲烷的影响

设置对照组，US预处理、FNA预处理及US-FNA联合预处理作为实验组，在实验运行的30天内，累计的甲烷产率如图7所示。从图7(a)可知，提高FNA浓度，累计甲烷产率从128.3 mLCH₄/gVSS增加到144.3 mLCH₄/gVSS。反映出细胞内容物释放为后续产甲烷过程提供了更多可代谢底物^[28]。FNA自身的抑菌性也会破坏厌氧微生物的活性^[29]，因此本实验中FNA浓度最高的F5组（3.55 mg/L）产甲烷速率略低。

图 7  US-FNA联合预处理对污泥产甲烷动力学的影响

Fig. 7  Effect of US-FNA synergy on sludge methanogenesis kinetics

由图7(b)可知，US-FNA联合预处理的甲烷产率均优于US预处理或FNA预处理，US-FNA联合预处理后污泥的最终甲烷产率为155.3 mLCH₄/gVSS（编号USF4），较UN增加了37.1%，分别是US预处理的1.07倍和FNA预处理的1.08倍。通过分析污泥预处理对有机物溶出（图4~图6）和甲烷产率（图7）的相似影响规律，可判断US-FNA联合预处理是US预处理与FNA预处理二者效应的简单叠加，并未观察到进一步提升污泥有机物溶出或甲烷产量的协同效应。

Gompertz模型为评估US-FNA联合预处理对于污泥产甲烷潜力转化和产甲烷动力学加速提供了有效手段^[18]，Gompertz模型对污泥产甲烷过程的拟合参数如表3所示。从表3可知，US预处理的有机物溶出表现优于FNA预处理，因此US预处理在厌氧消化初期未经历产甲烷迟滞期（λ）且获得了实验中最高的产甲烷速率（23.1 mLCH₄/(gVSS·d)）。FNA预处理（F2~F5）的甲烷产率集中在145.3~146.6 mLCH₄/(gVSS)之间，与US预处理基本持平。需要指出，FNA预处理确实对在厌氧消化早期表现出特定程度的抑制作用，表现在FNA预处理与US-FNA联合预处理中均可观察到初期产气迟滞现象（见图7），并反映在对应产甲烷动力学模型的λ取值均高于对照组和US预处理（λ=0）。然而，本研究中迟滞期λ不仅由于FNA的初期抑制而延长，较高FNA浓度的预处理提供的高浓度有机物溶出也会加快污泥降解产甲烷，进而抵消FNA的产气迟滞效应。总体而言，US对污泥的物理破解作用与FNA对污泥细胞的化学溶出和破解作用的联合使得产甲烷率升高，FNA单独存在会导致厌氧消化发酵前期产生动力学抑制。

表 3  污泥厌氧产甲烷的动力学拟合参数

Table 3  Kinetic parameters fitting methane production of sludge anaerobic digestion

预处理方式	编号	M/(mLCH4·gVSS-1)	Rmax/(mLCH4·gVSS-1·d-1)	λ/d	R2
对照组	UN	109.5	10.4	0	0.971 7
US预处理	US	144.6	23.1	0	0.992 0
FNA预处理	F1	129.6	12.9	1.5	0.995 6
	F2	146.4	13.4	1.6	0.993 3
	F3	146.2	12.0	1.2	0.990 8
	F4	146.6	10.7	0.7	0.986 3
	F5	145.3	10.0	0.2	0.979 0
US-FNA 联合预处理	USF1	155.2	14.0	2.0	0.992 9
	USF2	157.9	13.6	2.1	0.993 1
	USF3	152.7	13.2	2.1	0.985 1
	USF4	160.3	12.6	1.4	0.985 1
	USF5	160.8	10.1	0.7	0.980 4

注   R²为拟合系数。

2.5　US-FNA联合预处理对微生物群落的影响

有机物溶出可能改变厌氧消化的底物供给与限速步骤，同时预处理残留的FNA又引入了微生物环境的胁迫因素，因此有必要跟踪污泥发酵后期微生物菌群的变化。

Alpha多样性指数用于研究环境中微生物的多样性，可以通过单样本的多样性来分析反映微生物群落的丰富度和多样性^[30]。表4为不同预处理方式下细菌菌落的Alpha多样性指数。由表4可知，FNA自身的微生物毒性会影响微生物菌群，导致FNA组中细菌Chao指数和Ace指数的下降，反映了细菌物种丰富度的降低。与之相似，US-FNA联合预处理（USF4）污泥发酵后其厌氧菌群的Shannon指数降低、Simpson指数增加，二者的变化都能够表明FNA参与的污泥预处理会导致厌氧微生物菌群的多样性降低。

表4  不同预处理方式下细菌菌落的Alpha多样性指数

Table 4  Alpha diversity index of bacterial colonies under different pretreatment conditions

编号	Sobs	Shannon	Simpson	Ace	Chao	Coverage
UN	1 093	4.863 118	0.025 853	1 207.288 0	1 200.171	0.995 327
US	1 059	4.975 985	0.023 321	1 216.574 6	1 196.156	0.994 579
F4	875	4.764 210	0.022 929	996.924 96	1 009.252	0.995 611
USF4	830	4.563 118	0.027 919	981.923 37	982.552 6	0.995 173

表5为不同预处理方式下古菌菌落的Alpha多样性指数。由表5可知，FNA同样是改变古菌多样性的主要因素，FNA的添加会增加古菌多样性。如FNA预处理的Shannon指数由未处理污泥对照组（UN）的0.463 332增加到1.146 638。

表5  不同预处理方式下古菌菌落的Alpha多样性指数

Table 5  Alpha diversity index of archaea colonies under different pretreatment conditions

编号	Sobs	Shannon	Simpson	Ace	Chao	Coverage
UN	20	0.463 332	0.832 869	20.874 413	21.0	0.999 931
US	18	0.663 791	0.736 811	19.637 579	18.5	0.999 931 1
F4	24	1.146 638	0.450 786	26.348 122	24.6	0.999 896
USF4	16	0.981 004	0.487 008	16.000 000	16.0	1.000 000

门水平上的微生物菌群在不同预处理方式下呈现出的多样性更为丰富，如图8(a)所示。细菌群落方面，厌氧消化反应器中的优势菌群有Firmicutes（厚壁菌门）、Bacteroidota（拟杆菌门）、Proteobacteria（变形菌门）、Chloroflexi（绿弯菌门）和Actinobacteriota（放线菌门）等，各菌群的相对丰度均受到污泥预处理方式的影响。如Firmicutes（厚壁菌门）在US预处理中丰度最高（22.91%），US-FNA联合预处理（16.95%）和FNA预处理（13.96%）次之，而未经预处理的对照组（UN）中相对丰度仅为11.82%。在属水平上的优势菌群为水解酸化功能菌norank_ f_norank_o_Aminicenantales，如图8(c)和图8(e)所示。虽然污泥预处理均降低了该细菌的相对丰度，由UN组的8.29%降低至US-FNA联合预处理（USF4）的7.63%、US预处理的6.22%，直至FNA预处理（F4）的2.17%，但此类菌群丰度演变为何呈现如此规律仍未可知。此外，属于厚壁菌门的norank_f_norank_o_norank_c_norank_p_Firmicutes在各预处理组发酵后污泥中的相对丰度依次为：US预处理（11.14%）、US-FNA联合预处理（USF4，6.22%）、UN组（5.02%）和FNA预处理（F4，1.50%）。据报道，此类细菌的主要功能是将碳水化合物转化为丁酸与乙酸，为产甲烷菌提供底物^[31]。

图8  US-FNA联合预处理对厌氧微生物群落结构的影响

Fig. 8  Effects of US-FNA synergy on anaerobic microbial community

从图8(b)可以看出，古菌在门水平上Halobacterota（盐杆菌门）在本研究中占据主导地位，其相对丰度依次为：UN组（91.43%）、US预处理（85.68%）、US-FNA联合预处理（USF4，64.13%）与FNA预处理（F4，62.30%），由上述变化可知，FNA可能会抑制Halobacterota的丰度。Euryarchaeota（广古菌门）与Halobacterota变化规律相反，采用FNA预处理的2组样品中Euryarchaeota的相对丰度均高于US预处理与UN组。在属水平上，如图8（d）和图8（f）所示，以乙酸为代谢基质的Methanosaeta（产甲烷丝菌属）在各预处理样品中的相对丰度排序与Halobacterota（盐杆菌门）的变化规律一致。氢营养型产甲烷菌Methanobacterium（产甲烷杆菌属）呈现与上述规律几乎相反的演变规律，其相对丰度由高到低依次为：US-FNA联合预处理（USF4，31.44%）、FNA预处理（F4，28.13%）、US预处理（7.88%）、UN组（4.25%），这可能意味着FNA预处理提升了污泥厌氧消化的噬氢产甲烷代谢途径。

3 结论

本研究从有机质溶出、絮体分散、细胞内容物释放及产甲烷性能等方面系统研究了超声波（US）与游离亚硝酸（FNA）联合预处理是否存在协同机制，并初步探讨了预处理条件对于厌氧消化微生物菌群的影响规律。

3.1 相比于单一预处理，US-FNA联合预处理在有机物溶出量、甲烷产率等方面取得了较好的预处理效果。

3.2 US预处理有利于絮体分散并剥离胞外聚合物，而FNA预处理主要作用于破坏细胞完整性、释放细胞内容物，二者在联合预处理中发挥着相对独立的作用，其共同作用近似于二者的简单叠加，并不存在协同增效作用。

3.3 FNA对微生物的抑制性可能造成发酵前期产甲烷迟滞，但对于累积甲烷产率不会造成明显的负面影响。根据发酵后污泥微生物菌群的解析，发现FNA是影响污泥微生物多样性的主导因素，主要降低了门水平上Firmicutes（厚壁菌门）的相对丰度，在属水平上抑制了为产甲烷提供底物的水解酸化菌norank_ f_norank_o_norank_c_norank_p_Firmicutes的相对丰度。古菌方面，FNA降低了Halobacterota的相对丰度，提高了Euryarchaeota的相对丰度，并且可能对于污泥厌氧消化的噬氢产甲烷代谢途径具有提升作用。